01文章信息

发表杂志名称：Journal of Translational Medicine

中文标题：基于通路的癌症转录组解析膀胱癌分类中的高分辨率内在异质性

英文标题：Pathway-based cancer transcriptome deciphers a high-resolution intrinsic heterogeneity within bladder cancer classification

影响因子：7.5

发表日期：2025 年 6 月 17 日

01研究概述
膀胱癌（BLCA）的异质性受其内在转录特性和肿瘤微环境（TME）影响，基质转录成分可能掩盖癌细胞的内在生物学转录特征。本研究利用 GSE135337 的 BLCA 单细胞转录组数据识别纯肿瘤细胞，通过基于通路的转录组分类探索内在异质性细胞亚群，并在 TCGA BLCA 数据集中揭示内在亚型，结合机器学习识别潜在靶点并验证。结果成功鉴定出四种具有不同分子、功能和表型特征的内在亚型：MA 和 DP 亚型恶性表型显著、预后差，MA 亚型对免疫治疗响应最佳；DSM 亚型免疫丰富、预后最佳；HM 亚型自噬和坏死水平高且为 “免疫热” 微环境。这些亚型分类具有良好的预测和预后价值，还发现 DP 亚型中与代谢紊乱及 BLCA 分期分级相关的三个潜在靶基因（DAD1、CYP1B1、REXO2）。研究为理解肿瘤内在异质性提供了平台，靶向 REXO2 可能通过调节线粒体相关代谢紊乱改善患者预后。

01研究结果

图 1：膀胱癌内在恶性亚型的识别流程图

作者展示了研究的整体流程，分为四个步骤：第一步是发现膀胱癌肿瘤微环境中的复杂相互作用，涉及单细胞 RNA-seq 数据（GSE135337）的收集、细胞聚类和注释等；第二步是识别四个肿瘤内异质性细胞亚群（BCIS1-BCIS4）；第三步是分析四个膀胱癌亚型的异质性，包括预后、功能、临床特征、免疫景观和基因组改变等；第四步是识别膀胱癌恶性亚型的核心基因，通过机器学习算法筛选并进行临床分析和实验验证。该图清晰呈现了从数据收集到核心基因验证的完整研究框架。

图 2：膀胱癌恶性上皮细胞的细胞图谱及四个主要生物学状态的鉴定

作者通过多个子图展示相关结果：（图 2A）呈现 36407 个肿瘤细胞的 UMAP 图，按聚类着色；（图 2B）为 7 个肿瘤患者样本来源的 UMAP 图，按患者着色；（图 2C）是各细胞簇差异表达基因（DEG）表达的小提琴图；（图 2D）展示 36407 个肿瘤细胞按相关细胞类型着色的 UMAP 图，识别出 T 细胞、内皮细胞、髓系 / 巨噬细胞、成纤维细胞和上皮细胞五种细胞簇；（图 2E）为细胞周期分析预期结果的 UMAP 图，显示多数上皮细胞处于 S 期，促进膀胱癌进展；（图 2F）是各样本五种细胞类型的比例图，上皮细胞占比最高；（图 2G、H）为五种细胞类型间相互作用的数量和强度网络及热图，成纤维细胞与上皮细胞、内皮细胞与上皮细胞、髓系 / 巨噬细胞与上皮细胞间存在高频高强度相互作用，其中 MDK-NCL 和 MDK-SDC2 在成纤维细胞与上皮细胞相互作用中起关键作用；（图 2I）展示 scBiPaD 的计算框架；（图 2J）为 k 值 2-9 的 CDF 图及 CDF 曲线下面积的相对变化；（图 2K）是将所有细胞分为四个亚群后的共识矩阵热图；（图 2L）为各样本中四个亚群的分布 plot，显示患者间恶性细胞异质性显著；（图 2M）是单细胞亚群按频繁激活通路（5253 个中的 40 个）分类的生物学活性热图，定义了 BCIS1-BCIS4 四个亚群的特征通路。作者通过这些结果构建了膀胱癌单细胞转录组图谱，揭示了基质细胞与上皮细胞的显著相互作用，并鉴定出四个具有不同生物学功能的恶性上皮细胞状态。该图全面呈现了膀胱癌的细胞组成、相互作用及恶性上皮细胞的异质性亚群。

图 3：膀胱癌肿瘤内异质性分子亚型在批量队列中的建立、验证及各亚型的临床特征

作者通过子图呈现结果：（图 3A）为 TCGA 队列中四个亚型的总生存期（OS）、疾病特异性生存期（DSS）和无进展生存期（PFS）分析，显示亚型与预后显著相关，DSM 亚型预后最佳，DP 亚型最差；（图 3B）是 IMvigor210 队列中四个亚型的 OS Kaplan-Meier 图，DP 亚型预后最差，MA 亚型因对阿替利珠单抗响应最佳而预后最好；（图 3C）为基于通路分类与先前报道的共识分子分类的桑基图，显示通路 - based 亚型与现有分类重叠少；（图 3D）是 TCGA-BLCA 队列临床特征的单变量和多变量 Cox 回归分析，年龄、分期、T 分期等影响预后，年龄≤65 岁、N3/4 期、M1 期是独立预后指标；（图 3E）展示四个亚型的临床特征差异，年龄、性别和生长模式在亚型间有显著差异；（图 3F）为四个亚型的肿瘤生长模式分布，DP 亚型非乳头状生长模式比例高；（图 3G）显示 IMvigor210 队列中四个亚型的免疫治疗敏感性分布，DP 亚型对免疫治疗响应最差。该图验证了膀胱癌内在亚型的稳定性、预后价值及与临床特征的关联。

图 4：四个膀胱癌异质性亚型的功能富集及细胞死亡相关通路差异

作者通过子图展示：（图 4A）为四个亚型中六种细胞死亡（凋亡、自噬、坏死等）相关 55 个通路的 GSVA 热图，MA 亚型中焦亡和坏死性凋亡相关通路上调，其余多数细胞死亡通路富集少，DSM 亚型凋亡和自噬相关通路升高，所有亚型均显著表达坏死和溶酶体依赖的细胞死亡相关通路；（图 4B-E）为各亚型的富集网络图和 KEGG 富集分析，MA 亚型以异常 RNA 代谢等为特征，DSM 亚型富集免疫相关通路，DP 亚型与神经系统和血管系统调节通路相关，HM 亚型富集细胞稳态维持相关通路。该图揭示了四个亚型在细胞死亡机制和生物学功能上的显著差异。

图 5：不同膀胱癌亚型的肿瘤免疫微环境景观

作者通过子图呈现：（图 5A）为 ssGSEA 算法分析的 28 种免疫细胞浸润丰度热图，DP 亚型免疫抑制特征强，有髓系来源抑制细胞和调节性 T 细胞，MA 亚型免疫细胞浸润少（免疫荒漠表型）；（图 5B）是 MA 亚型的免疫图谱，显示其免疫抑制环境；（图 5C）为共刺激和共抑制受体的相对表达，DSM 亚型共刺激和共抑制受体激活增加，提示对免疫治疗敏感；（图 5D）展示抗原处理和呈递机制评分（APS），DSM 亚型 APS 高；（图 5E）为肿瘤炎症特征（TIS）评分，DSM 亚型最高，提示对 ICB 治疗潜在敏感；（图 5F）显示免疫评分、基质评分和肿瘤纯度，DSM 亚型肿瘤纯度低，MA 亚型相反；（图 5G）比较四个亚型的免疫指标，MA 亚型免疫原性高、基因组不稳定、T 细胞受体（TCR）丰富度低，DSM 亚型 TCR 丰富度高。该图全面展示了各亚型的免疫微环境特征及对免疫治疗的潜在响应差异。

图 6：通过机器学习算法识别膀胱癌恶性亚型核心基因及相关分析

作者通过子图展示：（图 6A）为随机森林（RF）分析结果，筛选出 8 个潜在核心基因；（图 6B）是 DP 亚型特征基因在 TCGA BLCA 队列中的单变量 Cox 回归分析；（图 6C）为 LASSO 回归模型分析，选出 27 个有非零系数的基因；（图 6D）是韦恩图，识别出 DAD1、CYP1B1、REXO2 三个核心基因；（图 6E-G）为三个基因的单基因 GSEA 富集分析，DAD1 富集于细胞生长等通路，CYP1B1 和 REXO2 富集于能量代谢等通路；（图 6H-J）显示三个基因与 22 种浸润免疫细胞的相关性，均与多种免疫细胞正相关。该图明确了 DP 亚型中与恶性表型相关的三个核心基因及其功能和免疫相关性。

图 7：核心基因的临床恶性表型及实验验证结果

作者通过子图呈现：（图 7A）为 TCGA BLCA 队列中三个基因高 / 低表达组的 OS Kaplan-Meier 图，高表达组预后差；（图 7B、C）显示三个基因在不同分期和分级中的表达，高分期和高分级患者中表达更高；（图 7D）为 Western blot 结果，显示不同肿瘤分期中三个基因的蛋白表达；（图 7E）是蛋白表达定量柱状图，验证了蛋白表达与分期的关联；（图 7F）为四个肿瘤分期中 DAD1 和 CYP1B1 的免疫组织化学（IHC）结果。该图验证了三个核心基因与膀胱癌临床恶性程度的关联，确认为恶性基因。

本研究整合膀胱癌单细胞 RNA-seq 和批量 RNA-seq 数据，探索肿瘤微环境中的细胞间相互作用，基于通路的癌症转录组分类识别出四种具有不同分子、功能和表型特征的膀胱癌内在亚型（MA、DP、DSM、HM），其中 MA 和 DP 亚型呈恶性表型且预后差，DSM 亚型为免疫丰富型，HM 亚型自噬和坏死水平高；通过机器学习算法在预后最差的 DP 亚型中识别出与代谢紊乱及膀胱癌分期、分级相关的三个潜在靶基因（DAD1、CYP1B1、REXO2），并实验验证其恶性作用。研究为理解膀胱癌内在肿瘤异质性提供了新平台，为个体化治疗策略提供了新思路，靶向 REXO2 可能通过调节线粒体相关代谢紊乱改善患者预后。