1. p53 Lys120 Acetylation Is a Key Regulator of Endothelial Cell Senescence
作者首先获得了38个年轻(20±3.4 years) 和34个年老(80±2.3 years)患者的肠系膜动脉样本（非心血管疾病患者），检测了端粒长度和SAβG (senescence-associated β-galactosidase)，并进行了RNAseq，发现p53显著激活(p53/p21 and p16INK4a/pRB这两条肿瘤抑制通路此前被报道与senescence相关，见免疫衰老)(a-d)。p53的靶基因p21 (CDKN1A)和MDM2显著上调(e)，p53, p16和p21均显著上调(f)。接着作者对年轻和年老的内皮进行了ATAC-seq，鉴定出2579个差异性peak(g)。但p53 binding motif的可及性未出现显著变化(h)，其结合于CDKN1和MDM2的prototer区也未出现显著变化(i)，提示衰老内皮中p53引起的转录变化不是chromatin rearrangement介导。因此作者推测p53 activity出现了变化。
因此作者进一步检测了p53 activity。作者首先检测了p53的亚细胞定位，发现衰老内皮中p53在细胞核中显著增加(a)。由于p53在胞核内的活性依赖于其乙酰化，作者发现衰老内皮中p53乙酰化也增加(b)。与此一致的是，衰老细胞中p53与乙酰转移酶TIP60和 MOF显著结合，与MOZ也显著结合(c)。此前文献报道过MOZ可以引起p53的K120位点乙酰化促进衰老，作者发现衰老细胞中MOZ-p53 complex增加(d)。使用nicotinamide抑制去乙酰化酶sirtuin 1并不改变K120的乙酰化状态(e)，提示MOZ 和 p53 的结合对其乙酰化至关重要。既往文献报道MOZ-p53结合依赖于AKT介导的MOZ磷酸化(on T369)。在衰老细胞中，作者检测到了AKT磷酸化水平的下降(f)，MOZ的磷酸化水平也下降(g)。接着作者使用了PI3K 抑制剂 LY294002，显著降低了年轻内皮细胞中的AKT磷酸化水平，增加了p53的K120乙酰化(h)。使用AKT激活剂在衰老内皮中得到了相反的结果(i)。作者还使用了p53乙酰化位点突变的质粒验证了其乙酰化作用(j)。
为了探究p53激活在内皮细胞衰老中的作用，作者使用了年轻内皮细胞，并进行了多重传代。作者使用CRISPR敲除了内皮中的p53，并使用慢病毒转染了wild-type p53 或 non acetylatable p53-K120R mutant，多重传代后，在p53敲除和non acetylatable p53-K120R mutant转染细胞中，细胞数量和EdU显著上升(k,l)，SAβG沉积显著下降(m)。Thus, these data indicate that senescence of native human endothelial cells is linked to an increase in nuclear p53 levels and its acetylation, which ensures its activation to result in attenuated endothelial cell proliferation.
2. Impact of p53 on Metabolic Reprogramming and Endothelial Cell Proliferation
由于p53被报道参与调控细胞代谢，尤其是通过负性调节Glut1调节糖代谢，作者对年轻的衰老的细胞进行了代谢组学分析。发现衰老细胞存在7个上调的胞内代谢物和10个下调的代谢物(a, b)。尤其是衰老细胞中的glucose, glucose-6-phosphate, 和 pyruvate显著下降(c)，提示衰老细胞糖酵解下降。在肿瘤细胞中，p53可以诱导fructose-2,6-bisphosphatase (TIGAR) 的表达并抑制PGM，从而抑制Glut1 和 Glut4 的表达。同样在衰老细胞中，作者发现了TIGER的上调及Glut1 和 Glut4的下调。通过p-53的ChIP-qPCR，作者发现衰老细胞中 ac-p53 (K120) 与 GLUT1 启动子区结合增加(e)，同时GLUT1蛋白表达下降(f)。降低的Glut1表达与衰老细胞中下降的glucose import有关(g)，同时ATP也下降(h)。
3. Impact of p53-Induced Metabolic Reprogramming on Telomerase Activity
接着作者探究了代谢变化对衰老的影响。作者使用cell-permeable ATP analog处理了衰老内皮，发现细胞增殖显著增加(a)，端粒长度也增加，端粒酶活性也增加(b)。敲除p53后这种现象消失，而同时过表达wt p53而不是p53 K120R mutant，抵消了敲除p53对端粒酶的影响(c)。p53下调后p21也下降，Glut1上升，同样的，过表达wt p53而不是p53 K120R mutant抵消了这种作用(d)。
端粒酶复合体的组装是一个耗能过程，需要招募ATP-dependent chaperones。为了探究内皮细胞衰老对telomerase complex的影响，作者对TERT (telomerase reverse transcriptase)的催化亚基进行了IP，发现了TERT互做蛋白收到了aging的显著影响(e)。在年轻内皮细胞中，5种伴侣蛋白与TERT结合，包括此前报道过的HSP90，而这些互做在衰老内皮中未检测到。TERT互做蛋白中，HSP9a是ATP-dependent chaperone，其在年轻内皮中与TERT互做，在衰老细胞中互做下降(f)。敲除p53或者过表达非乙酰化的p53 mutant重塑了HSP9a与TERT的结合(g)。
端粒酶功能对细胞分裂是不可或缺的。为了区分ATP依赖和端粒酶依赖的内皮细胞增殖作用，作者使用了lenti-CRISPR approach降低年轻原代内皮细胞中TERT的表达，发现细胞衰老加速(h)。此外，ATP analog可以增加对照组而非TERT-deficient组的细胞增殖，提示ATP preserves proliferation only in the presence of TERT。
4. Cystathionine γ-Lyase Anchors p53 in the Cytoplasm and Prevents the MOZ-Mediated Acetylation of p53
接着作者探究了衰老细胞中p53的调控机制。由于CSE代谢物cystathionine在衰老内皮中显著增加(Figure 3B)，且此前文献报道内皮中CSE可以与p53结合，作者主要聚焦于CSE (cystathionine γ-lyase)。实验结果显示内皮中CSE直接与p53结合，且该结合作用主要位于胞浆(a,b)。docking实验预测了其结合位点，而突变这些位点两者结合下降(c,d)。p53与CSE的结合并未引起其S-sulfhydration(e)，CSE的活性也未出现变化，表现为H2S的产生未出现显著变化(f)。为了研究与CSE的结合是否影响p53的核转位，作者使用doxorubicin诱导DNA损伤和p53核转位。在转入GFP空载细胞中，doxorubicin增加了内皮细胞中的p53核转位，而转入ad-CSE的细胞胞内p53潴留增加(g)。
5. Deletion of CSE Results in Premature Endothelial Cell Senescence
小鼠实验显示，敲除内皮细胞的CSE引起显著SAβG沉积，细胞增殖减慢，停滞于s期的细胞增多，提示细胞周期停滞(a-c)，端粒长度也下降(d,e)。尽管端粒酶核心亚基Tert和Terc的表达未显著变化，端粒酶活性显著下降(f,g)。RNAseq同样提示敲除CSE后衰老基因上升，衰老负性调节基因下降(h)。
To assess the consequences of CSE-dependent endothelial cell senescence, we evaluated the vascular reactivity and arterial stiffness of mice lacking endothelial CSE. 发现CSE敲除在小鼠中促进了内皮衰老。
6. CSE Re-expression as a Novel Approach to Reduce p53 Activity, Preserve Telomerase Function, and Delay Endothelial Cell Senescence
Next, we tested the hypothesis that the re-expression of CSE in senescent endothelial cells could rescue endothelial cell proliferation and vascular repair.
