01文章信息

发表杂志名称：Gut

中文标题：靶向调节性 T 细胞-成纤维细胞相互作用以增强脂肪性肝病相关肝细胞癌的免疫治疗

英文标题：Targeting Treg–fibroblast interaction to enhance immunotherapy in steatotic liver disease-related hepatocellular carcinoma

影响因子：25.8

发表日期：2025 年 7 月 22 日

01研究概述

脂肪性肝病相关肝细胞癌（SLD-HCC）具有独特的肿瘤微环境（TME），其代谢和免疫适应导致免疫治疗抵抗，但具体免疫相互作用机制尚不明确。作者采用单细胞转录组学、飞行时间质谱流式细胞术（CyTOF）、两种独立的空间转录组学平台，研究了 22 例 SLD-HCC 和 31 例非 SLD-HCC 的 TME，并在 103 例患者的独立队列、HCC 模型及免疫治疗患者队列中验证。结果发现，调节性 T 细胞（Tregs）和癌相关成纤维细胞（CAFs）的免疫及脂质代谢通路显著改变，SLD-HCC 的 TME 呈 “冷” 免疫抑制状态，Treg-CAF 簇定位于肿瘤边缘，TNFSF14-TNFRSF14 介导的二者相互作用是免疫治疗抵抗的关键驱动因素。在高脂饮食的 HCC 模型中阻断 TNFRSF14，可减少 Tregs、增加活性 CD8⁺和记忆 CD4⁺T 细胞，并与抗 PD-1 治疗协同增强抗肿瘤免疫，克服抵抗。该研究揭示了 SLD-HCC 的关键免疫和代谢适应，确定 TNFSF14-TNFRSF14 信号轴为潜在治疗靶点。

01研究结果

图 1：SLD-HCC 和非 SLD-HCC 的单细胞转录组图谱

作者采用多组学方法（图 1A）研究了 SLD-HCC 和非 SLD-HCC 的 TME，SLD-HCC 定义为肝内脂肪至少 5% 且有至少一个代谢危险因素，非 SLD-HCC 则不满足这些标准，两者均显示出气球样变和免疫浸润相关炎症（图 1A、补充图 S1A），且关键临床参数无显著差异（补充图 S1B）。对 5 例 SLD-HCC 和 6 例非 SLD-HCC 的肿瘤及非肿瘤组织进行单细胞转录组分析，65606 个单细胞的无监督聚类识别出 27 个簇，归类为 17 种主要细胞类型，包括免疫细胞、成纤维细胞、内皮细胞和肝细胞（图 1B、1C、补充图 S2A、S2B、S2C、表 S3）。细胞比例分析显示，大多数肝细胞来自肿瘤，其他细胞类型来自肿瘤和非肿瘤组织，肿瘤肝细胞群体受个体患者驱动，显示出患者间异质性，其中 APOA2⁺肝细胞主要来自 SLD-HCC，富集脂质代谢相关载脂蛋白，与脂肪性 HCC 表型一致，其他细胞类型在患者中分布均匀（图 1D、补充图 S2C-S2F）。作者比较 SLD-HCC 与非 SLD-HCC 肿瘤组织中各细胞类型的表型，通路分析显示 SLD-HCC TME 中的 CD4⁺和 CD8⁺T 细胞下调免疫或炎症反应相关通路，而 Tregs、内皮细胞（ECs）和 CAFs 上调脂质或脂肪酸过程相关基因和通路（图 1E）。Tregs 上调 TXNIP、FABP1 及载脂蛋白家族成员（APOA2、APOC1、APOA1）等脂质代谢相关基因，下调抗原呈递（HLA-DRB5、HLA-DPA1）、淋巴细胞活化（CREM、IL2RA、ICOS）及免疫球蛋白相关基因（图 1F）。SLD-HCC 的 CD8⁺T 细胞下调脂质代谢（FABP5、APOC3、APOC1）和细胞毒性免疫功能或抗原呈递相关基因（CST7、CCL5、HLA-DPB1）（图 1F）。CAFs 上调脂质代谢相关基因（APOA1、FABP1、APOH）及纤维化相关基因（COL4A2、COL4A1、FGB、FGG），下调与纤维化调节相关的热休克蛋白基因（HSPA1A、HSPA1B、HSPA6）（图 1F）。SLD-HCC 相关 ECs 也上调脂质代谢基因（FABP1、APOA1、APOC1）和 CD36，富集 CXCR4，下调热休克蛋白（HSPB1、HSPA6、HSPA1A）（图 1F）。综上，单细胞 RNA 测序数据表明 SLD-HCC 微环境中存在明显的代谢重编程，Tregs、成纤维细胞和 ECs 中脂质代谢通路富集，反映了它们对脂肪性环境的共同适应。

图 2：SLD-HCC 和非 SLD-HCC 的免疫景观分析

作者使用 CyTOF 对 17 例 SLD-HCC 和 27 例非 SLD-HCC 的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）进行分析，1663336 个单细胞通过抗体面板（补充表 S4）分析，无监督聚类识别出 49 个簇，分为 7 种主要免疫谱系，包括 CD4⁺T 细胞、CD8⁺T 细胞、B 细胞、自然杀伤（NK）细胞和抗原呈递细胞（图 2A、补充图 S3A-S3C）。总体而言，与非 SLD-HCC 相比，SLD-HCC 的瘤内 CD4⁺T 细胞密度更高，CD8⁺T 细胞减少（图 2B、2C、补充图 S3D、S3F）。几种与较差预后相关的免疫抑制性 CD4⁺T 细胞，包括 CD25⁺FOXP3⁺Tregs 及表达 PD-L1、GITR、PD-1 的 CD4⁺记忆 T 细胞，在 SLD-HCC 中显著富集（图 2D、2E）。同时，SLD-HCC 中耗尽的和颗粒酶 B⁺活性 CD8⁺T 细胞以及 CXCR3⁺NK 细胞减少（图 2D、2E）。在非病毒性 HCC 病例的亚分析中，也观察到类似的免疫表型（Tregs 增加，总 CD8⁺T 细胞减少），表明这些特征与 SLD-HCC 相关，与 HBV 状态无关（补充图 S3E、S3F）。对健康肝脏、MASLD 早期或 MASH 晚期患者的单细胞转录组数据（GSE159977）分析发现，与健康肝脏相比，MASLD 中 Tregs 有增加趋势，MASH 中 CD8⁺T 细胞减少，表明免疫抑制微环境可能在 SLD 早期出现（补充图 S4A、S4B）。作者在 103 例患者（41 例 SLD-HCC，62 例非 SLD-HCC）的独立队列中进行多重免疫荧光（mIF）验证，发现 SLD-HCC 中总 CD4⁺T 细胞、记忆 CD4⁺T 细胞和 Tregs 显著富集，CD8⁺T 细胞减少，且在仅非病毒性 HCC 病例中数据一致（图 2F、2G、补充图 S3G）。由于 CD8⁺细胞毒性 T 细胞的瘤内耗尽标志的免疫排斥与 Wnt 信号通路相关，作者检测了 bulk RNA-seq 数据中的 KEGG_Wnt 信号通路评分，发现 SLD-HCC 的评分更高，与免疫排斥肿瘤一致（图 2H）。此外，SLD-HCC 的新抗原评分更低，与之前报道的 MHC I 类相关新抗原数量与 T 细胞溶细胞活性相关一致（图 2I）。综上，SLD-HCC 的特征是免疫排斥微环境，表现为细胞毒性 CD8⁺T 细胞耗尽和免疫抑制性记忆 CD4⁺T 细胞及 Tregs 富集。

图 2 总结：SLD-HCC 的免疫景观呈 “冷” 免疫抑制状态，表现为 CD8⁺T 细胞减少、免疫抑制性 CD4⁺T 细胞（包括 Tregs）富集，且与 Wnt 信号通路激活和新抗原评分低相关。

图 3：SLD-HCC 和非 SLD-HCC 的空间结构

为揭示关键细胞群的空间组织，作者对 7 例 SLD-HCC 和 5 例非 SLD-HCC 的 FFPE 组织进行 Visium 空间转录组学（ST）分析（图 3A、补充表 S1），Visium 是基于点的转录组学分析，每个 55μm 的点捕获多个细胞的转录本，共分析 12 个组织切片的 126099 个点，平均每个点 9698 个 UMI 和 3708 个基因（补充图 S5A）。所有组织切片的标准化数据在均匀流形近似和投影（UMAP）中分布均匀（图 3B、补充图 S5B）。根据单细胞 RNA-seq 中识别的所有细胞类型的前 100 个基因对每个点评分，发现免疫细胞评分高的点，成纤维细胞和内皮细胞评分也高，表明它们在组织中接近，而肝细胞相关点的免疫细胞、成纤维细胞和内皮细胞评分低（图 3C）。使用 SpaCET 基于 TCGA 数据集的基因特征映射肿瘤位置，与基于 H&E 图像的组织学注释一致（图 3D）；使用空间感知聚类算法 Banksy 对每个组织样本进行分割（图 3E、补充图 S5D），发现 SLD-HCC 中免疫细胞评分高的区域与成纤维细胞评分高的区域在肿瘤边缘共定位，而非 SLD-HCC 中这些区域则分散在组织中（图 3D、3F、补充图 S5D、S5E）。综上，Visium ST 数据显示 SLD-HCC 中免疫细胞和成纤维细胞群体可能在肿瘤边缘相互作用。

图 3 总结：SLD-HCC 和非 SLD-HCC 具有不同的空间组织，SLD-HCC 的免疫细胞和成纤维细胞群体在肿瘤边缘存在潜在相互作用，而非 SLD-HCC 中这些细胞群体分布较分散。

图 4：SLD-HCC 和非 SLD-HCC 的细胞相互作用网络

Visium ST 分析识别了细胞群体间的潜在相互作用，但因其分辨率有限，作者对单细胞 RNA-seq 数据进行细胞 - 细胞相互作用分析，发现 SLD-HCC 中 Tregs 和 CD4⁺T 细胞的相互作用强度相对增加，而浆细胞样树突状细胞（pDC）、巨噬细胞、库普弗细胞和 CD8⁺T 细胞的相互作用强度降低（补充图 S6A）。为进一步验证，作者使用 CosMx 空间分子成像（单细胞分辨率的空间转录组学），对 2 例 SLD-HCC 和 2 例非 SLD-HCC 的 FFPE 组织进行分析，组织切片染色 CD45（免疫细胞）、CD3（T 细胞）、泛细胞角蛋白（上皮细胞）和 DAPI（细胞核），在 4 个组织中选择涵盖肿瘤核心、肿瘤边缘和非肿瘤区域的 50 个视野（FOV）（图 4A、补充图 S7A）。细胞分割识别出 152214 个细胞， Leiden 聚类将其分为 25 种细胞类型，基于高表达基因注释（图 4A-4C、补充表 S6），共检测到 993 个基因的 52118623 个转录本，平均每个细胞 270 个转录本。识别出的细胞群体包括 CD4⁺和 CD8A⁺T 细胞、髓系和树突状细胞（表达 CD74、CIITA、HLA-DPA1）、浆细胞（表达 IGHG1、IGHG2、JCHAIN）和成纤维细胞（表达 COL1A1、COL1A2、COL5A1），与单细胞 RNA-seq 聚类一致，肝细胞是最丰富的细胞类型（图 4C、4D、补充图 S8A、表 S6）。Treg 群体高表达 ICOS 和 PDCD1，二者与高度免疫抑制性 Treg 表型相关（图 4C、补充表 S6）。同时，观察到 PD-1⁺耗尽的 CD8⁺T 细胞和 CD163⁺肿瘤相关免疫抑制性巨噬细胞（图 4C、补充表 S6）。成纤维细胞群体中，一种富集胶原基因，另一种表达促炎基因 CCL2、CXCL12、IL1R1（类似激活的成纤维细胞 / CAFs），与癌症进展和治疗相关（图 4C、补充表 S6）。作者对 CosMx 数据进行邻域富集分析，发现与 CAFs 相互作用的关键免疫细胞中，仅 Tregs 显示出显著相互作用；聚焦 Tregs，发现与非 SLD-HCC 相比，SLD-HCC 中 Tregs 与 CAFs 的相互作用显著增加，与初始 CD8⁺T 细胞的相互作用有增加趋势（图 4E、补充图 S9A、S9B）。在 Visium 数据中，基于单细胞 RNA-seq 数据的细胞类型解卷积一致显示，SLD-HCC 肿瘤边缘的 Tregs 与 CAFs 相关性显著高于非 SLD-HCC（图 4F、补充图 S9C）。对 6 例 SLD-HCC 和 6 例非 SLD-HCC 的 FFPE 样本进行 Tregs 和成纤维细胞的 mIF 验证，聚焦肿瘤边缘的视野，发现 SLD-HCC 中 Tregs 富集，且 Tregs 与成纤维细胞的平均距离更短，表明 SLD-HCC 肿瘤前缘存在 Treg-CAF 相互作用（图 4G、4H、4I）。

图 4 总结：SLD-HCC 和非 SLD-HCC 的细胞相互作用存在差异，SLD-HCC 的肿瘤边缘 Tregs 与 CAFs 的相互作用显著增强，表现为 Tregs 富集且与 CAFs 距离更近。

图 5：SLD-HCC 的配体 - 受体相互作用组

作者通过 COMMOT 分析（考虑空间距离和信号方向性的配体 - 受体对分析），从 CosMx 数据中识别出 SLD-HCC 中 Treg - 成纤维细胞和成纤维细胞 - Treg 相互作用的 11 个共同富集信号通路（图 5A）。另外，对 Visium 数据进行 NICHES 分析，识别出 12 个仅在 SLD-HCC 肿瘤边缘富集的配体 - 受体对（图 5B、补充图 S10A）。比较两种分析，发现 3 个共同的配体 - 受体对，其中仅肿瘤坏死因子超家族成员 14（TNFSF14）- 肿瘤坏死因子受体超家族成员 14（TNFRSF14）在 SLD-HCC 与非 SLD-HCC 的 COMMOT 评分中显示出显著更强的信号（补充图 S10B、S10C）。Visium 数据中 TNFSF14-TNFRSF14 的表达可视化显示，其在 SLD-HCC 的肿瘤前缘空间富集，而在非 SLD-HCC 中远离肿瘤边界（图 5C、补充图 S10D）。对解卷积的 Visium 数据进行 COMMOT 分析，一致发现 SLD-HCC 中 Tregs 与成纤维细胞之间的 TNFSF14-TNFRSF14 相互作用评分更高（图 5D）。此外，TNFSF14-TNFRSF14 的 COMMOT 分析显示，SLD-HCC 中信号方向从肿瘤向非肿瘤区域，尤其在肿瘤边缘，而非 SLD-HCC 中信号方向随机（图 5E、补充图 S10E）。mIF 分析进一步验证，SLD-HCC 边缘的 TNFSF14-TNFRSF14 表达富集（图 5E）。Visium 数据中，SLD-HCC（n=7）与非 SLD-HCC（n=5）边缘区域的 Treg-CAFs 和 CAFs-Treg 相互作用的 TNFSF14-TNFRSF14 COMMOT 评分比较显示，SLD-HCC 的相互作用更强（图 5F）。对 3 例免疫治疗应答者和 5 例非应答者的分析显示，SLD-HCC 中非应答者的 TNFSF14-TNFRSF14 相互作用强度显著高于应答者，而非 SLD-HCC 中无此差异（图 5G）。

图 5 总结：TNFSF14-TNFRSF14 介导的 Treg-CAF 相互作用在 SLD-HCC 的肿瘤边缘富集，且与免疫治疗抵抗相关，非应答者的该相互作用强度高于应答者。

图 6：阻断 Treg-CAFs 相互作用增强抗肿瘤免疫和对免疫检查点阻断（ICB）的应答

为验证 TNFRSF14 在免疫治疗抵抗中的作用，作者建立了小鼠模型：给 6 周龄雄性 C57BL/6 小鼠喂高脂饮食（HFD）7 周诱导脂肪肝微环境，然后肝内移植 1×10⁶个 Hepa1-6 鼠肝癌细胞，肿瘤建立 5 天后，每两周腹腔注射同型对照、抗 PD-1、抗 TNFRSF14 或二者联合，持续 2 周（图 6A），组织学分析证实该饮食方案成功诱导小鼠肝脂肪变性（补充图 S11A）。联合治疗显著减少肿瘤负担，5 只治疗小鼠中有 2 只完全肿瘤消退（图 6B、6C）。重要的是，联合治疗导致强烈的瘤内免疫应答，表现为瘤内 Tregs 比例减少，活性 CD8⁺T 细胞和活性记忆 CD4⁺T 细胞水平增加，且这种效应在肿瘤内更明显，非肿瘤肝组织中仅活性记忆 CD4⁺T 细胞有增加趋势（图 6D、补充图 S11B、S11C）。正如预期，单独 PD-1 阻断也显示活性 CD8⁺T 细胞增加，但联合治疗引发的免疫应答显著更强，与其在各治疗组中更优的肿瘤控制相关（图 6D）。对治疗小鼠肿瘤组织的 bulk RNA 测序显示，单独或与抗 PD-1 联合的抗 TNFRSF14 治疗富集免疫激活通路，而抗 PD-1 单药治疗与脂质代谢和胶原生物合成相关特征相关，包括已知的纤维化驱动因子 IL-13 信号通路（图 6E、补充图 S11D）。组织学分析显示，抗 TNFRSF14 组和联合组的脂肪变性减少（补充图 S11A）。空间 proximity 分析证实，抗 TNFRSF14 治疗破坏了 Treg - 成纤维细胞相互作用，表现为单药或联合治疗后二者距离增加（补充图 S11E）。未喂 HFD 的小鼠中，抗 PD-1 治疗未显示增强的应答（补充图 S11F）。

图 6 总结：在高脂饮食诱导的 HCC 模型中，阻断 TNFRSF14 可减少 Tregs、增加活性免疫细胞，与抗 PD-1 治疗联合能显著增强抗肿瘤免疫、减少肿瘤负担，且该效应具有 SLD-HCC 特异性。

本研究聚焦脂肪性肝病相关肝细胞癌（SLD-HCC），采用单细胞转录组学、CyTOF、空间转录组学等多组学方法，结合动物模型和临床样本验证，探究其肿瘤微环境（TME）的免疫和代谢特征及免疫治疗抵抗机制。研究发现，SLD-HCC 的 TME 呈 “冷” 免疫抑制状态，表现为 CD8⁺T 细胞减少、调节性 T 细胞（Tregs）和癌相关成纤维细胞（CAFs）富集，且二者在肿瘤边缘形成免疫抑制性 niche，通过 TNFSF14-TNFRSF14 信号通路相互作用，是免疫治疗抵抗的关键驱动因素。在高脂饮食的 HCC 模型中，阻断 TNFRSF14 可减少 Tregs、增加活性 CD8⁺和记忆 CD4⁺T 细胞，并与抗 PD-1 治疗协同增强抗肿瘤免疫，克服抵抗。该研究揭示了 SLD-HCC 的关键免疫和代谢适应机制，确定 TNFSF14-TNFRSF14 信号轴为增强免疫治疗 efficacy 的潜在靶点，为开发联合治疗策略以改善 SLD-HCC 患者临床结局提供了依据。