在核酸杂交实验中，探针（Probe）是进行杂交的关键“工具”，它是指能与目标核酸（DNA或RNA）序列特异性结合的、带有可检测标记的核酸片段，其核心功能是通过“特异性结合+信号显示”来定位目标核酸。不同类型的探针对应着不同的检测原理与方法，本文拟从“探针类型”和“检测方法”两个维度向大家展开详细介绍。
一、探针类型
探针的分类主要依据其携带的标记物。标记物可以帮助追踪和检测到探针与目标序列的结合情况。由此作为分类依据，可主要分为两大类：放射性标记探针和非放射性标记探针。
1.放射性标记探针
使用放射性标记物来标记核酸片段是分子杂交实验中最早使用的经典标记法。常用的放射性核素有³²P，³⁵S，³H，¹²⁵I 等，其中³²P由于具有放射性强、能量高的特点，是最常用的核酸标记物。
该类型探针的优势非常明显，具备极高的特异性与敏感性，可检测低至pg级的目标，但同时也存在较高辐射污染风险、标记物半衰期短（需及时使用）、操作繁琐（需专用防护设备）、检测时间长等问题，因此目前已逐渐被非放射性标记探针所取代。
2.非放射性标记探针
非放射性标记探针的敏感性虽不及放射性标记探针，但其稳定性好、检测时间短，并且研究者也无需担心放射性污染问题，因而在分子杂交领域中获得了广泛的应用。常用的非放射性标记探针有：荧光标记探针、地高辛标记探针以及生物素标记探针。
（1）荧光标记探针
荧光标记探针即是将荧光染料分子（如FITC，Cy3，Cy5等）直接连接到核酸上，通常是利用T7 RNA聚合酶以体外转录的方式来对RNA进行标记。不同染料分子受到激发后会发射不同波长的荧光（即不同颜色），可以同时区分和检测多个不同的目标分子，具备独一无二的多重检测能力。
（2）地高辛标记探针
地高辛（Dig）是一种从植物洋地黄中提取的类固醇物质。在动植物、微生物的天然组织中几乎不存在地高辛类似物，因此以地高辛标记探针进行相关杂交实验时背景极低，特异性极高，几乎不会出现非特异性结合造成的假阳性。可以说是目前最常用、性能最优越的非放射性标记系统。
常用的标记方法有随机引物法和PCR法，但怎么选择还需要看模板条件。如果有足够量的高纯模板，两种方法皆可；如果模板量有限或非常短时，PCR法则是最佳选择，相比于随机引物法会更加灵敏，可标记扩增极微量的模板。市面上主要使用随机引物法的试剂盒如Roche的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit，标记效率高；主要使用PCR法的试剂盒如百代生物的BIOG地高辛标记试剂盒，内含超级热启动Taq酶，可最大程度减少非特异性标记，使得合成的探针纯度高、产量高，两款试剂各有优势，研究者可根据模板条件自行选择。
（3）生物素标记探针
生物素（Biotin）是一种水溶性维生素（维生素B7/H），广泛存在于天然生物组织中。标记方法可通过DNA聚合酶、RNA聚合酶等酶类，将含生物素修饰的核苷酸（如Biotin-16- UTP、Biotin- 11-dUTP）掺入到探针中，适用于PCR产物、cDNA或RNA探针的标记，国内BIOG就拥有多种生物素标记试剂盒，可满足不同实验需求，相比于Roche的也会更加经济一些。
虽然该种探针在某些组织样本中由于内源性生物素的干扰而不太适用，但其强大的亲和力与灵敏度（生物素与亲和素/链霉亲和素的结合是已知最强、最稳定的生物相互作用之一）还是得到了很多研究者的青睐。
二、探针的检测方法
探针的检测方法完全取决于探针所使用的标记物。
1.放射性标记探针检测
放射性核素探针的检测方法主要为放射性自显影，这是最经典的检测方法，原理是放射性核素释放的射线（如β射线）能使感光材料（如X光胶片）发生感光反应，形成与探针结合位置对应的黑色条带或斑点，从而可直接观察靶核酸的存在和位置。
2.非放射性标记探针检测
（1）荧光标记探针检测
荧光标记探针的检测是最为方便快捷的，在杂交后无需后续偶联反应，可利用自身携带的荧光基团，在受激发光后发出特定波长的荧光，直接通过荧光显微镜、激光共聚焦扫描仪等仪器检测荧光信号分布位置即可。
（2）地高辛标记探针检测
地高辛标记探针需利用免疫酶促反应来进行检测，其巧妙地利用了半抗原-抗体反应的高特异性和酶催化反应的高灵敏度。具体为在杂交完成后，使用抗地高辛抗体对样本进行孵育，根据抗体上偶联的酶不同，检测方式可分为Dig –HRP（辣根过氧化物酶）检测体系（以DAB为底物，结果为棕色）与Dig –AKP（碱性磷酸酶）检测体系（以BCIP/NBT为底物，结果为蓝紫色沉淀）。但同样是酶促显色反应，AKP灵敏度和分辨率较HRP高出约10倍左右，非常适合于原位杂交实验结果的检测，可通过肉眼直接观察到探针杂交分布的情况（图1）。如果想进一步提高检测灵敏度，也可选择使用CDP-STAR化学发光底物，但CDP-STAR的合成难度较大，国内能做的公司只在少数，比如BIOG等品牌，该种方式适合于Southern、Northern、菌落杂交或斑点杂交等免疫检测。
（3）生物素标记探针检测
生物素标记探针的检测核心依赖于生物素与（链霉）亲和素之间超高强度的特异性结合。最常用的检测方法要数化学发光法，在杂交后使用HRP标记的链霉亲和素与样本进行孵育，使之与生物素标记探针结合，再利用ECL化学发光检测试剂进行检测即可。如果目标分子丰度极低，建议选择配置有超敏飞克极别化学发光液的生物素标记核酸检测试剂盒，像Roche、BIOG等，其检测灵敏度较普通ECL配方要高出10倍以上，即使是极微量的目标分子也可检出。
除了化学发光法以外，研究者也常常通过荧光检测法来检测，该方法尤其适合于需要对杂交信号进行二次放大的实验，例如以生物素标记探针进行的原位杂交实验，通过孵育亲和素标记荧光素（FITC-Avidin、Cy3-Avidin等等）后，可直接在荧光显微镜下进行结果观察，由于多级放大效应，该方法的灵敏度要更高，检测起来也非常方便。
