文献信息
标题：Sequencing-Based Protein Analysis of Single Extracellular Vesicles
DOI(url): Sequencing-Based Protein Analysis of Single Extracellular Vesicles | ACS Nano
日期及杂志：2021 Mar 23, ACS Nano
作者及单位：Jina Ko,Royal Institute of Technology (KTH), School of Engineering Sciences in Chemistry, Biotechnology and Health, Department of Gene Technology, Science for Life Laboratory, Solna, Sweden
文献概述(这篇文献的结论是什么？)
循环细胞外囊泡(EV)——从大多数哺乳动物细胞中脱落的生物纳米材料——已经成为有前途的生物标志物、药物传递囊泡和治疗调节剂。虽然不同类型的囊泡正在探索它的应用，但即使在同源或单克隆细胞群体中，人类EV也是相当异质性的。由于表面EV蛋白组成在很大程度上决定了它们的生物学行为，因此需要高通量的单EV分析方法来更好地定义EV亚群。在这里，我们提出了一种基于抗体的免疫测序方法（single EV immuno sequencing, seiSEQ），该方法允许从单个纳米大小的EV中多重测量蛋白质分子。我们使用液滴微流体对单个EV进行区隔和条形码。然后对条形码/抗体- DNA进行测序以确定蛋白质组成。利用这种高灵敏度的技术，我们在单个EV水平上检测了特定的蛋白质。我们期望这项技术可以进一步适用于任何纳米颗粒的多重蛋白质分析。
文献结果(每个结果的图片详细解读)
1、seiSEQ的液滴微流体平台
分离的EV首先用Ab-DNA标记，剩余未结合的Ab-DNA通过排阻色谱（SEC）除去，然后将Ab-DNA标记的EV与条形码珠（barcoded beads）一起封装成液滴。在液滴封装好后，依次进行多个延伸和扩增步骤以合成扩增子，然后对扩增子进行测序以确定特定囊泡的蛋白质组成。该方法使用不同的条形码来定义蛋白质类型(Ab-DNABC)和单个囊泡(Bead-DNABC)(图1A、C)。Bead- DNABC由三个序列区域组成:一个与Ab-DNABC互补的序列，一个独特的分子标识符(UMI)，以及三个组合较短的条形码区域{Bead- DNABC: Bead-(bc1 ' -bc2 ' -bc3 ')-UMI-a}，这是由三步分裂池方法制成的，因此通过测序扩增子可以以高多样性识别单个囊泡(图1B)。
2、单EV谱合成扩增子的验证
为了验证给定的扩增子合成，我们首先用转换的cDNA进行qPCR。图2A所示为4种不同样品的qPCR周期曲线:(1)50,000 EV的大样本，(2)500 EV的大样本，(3)350 EV的单个EV，(4)阴性对照，包含所有试剂，但不含EV。图2B将Ct = 32的PCR扩增样本(2、3、4)在凝胶上运行以确定扩增子大小。(2)和(3)在~150 bp处观察到两条主要条带，大小与模板序列(152 bp)相匹配。正如预期的那样，在对照样本(4)中没有EV缺失的波段。图2C使用Sanger测序将样品(3)的扩增子序列与原始模板序列设计进行比较。扩增子序列与模板序列设计匹配(蓝色:匹配序列，橙色:UMI，绿色:EV条形码，黑色:未匹配序列，大部分在条形码区域)。接下来的实验是用下一代测序来鉴定单个扩增子。
3、单EV分析的准确性和特异性
为了评估单EV分析技术的准确性，将抗EGFR抗体偶联到两个不同的DNA条形码序列上（图3A），大多数的reads都正确地与一个条形码序列或另一个条形码序列对齐，没有串扰。为了显示多重单EV分析的潜力，我们对从RAW 264.7小鼠巨噬细胞系获得的1100 EV中的8个蛋白(CD9, F4/80, CD11b, CD63, CD45, CD81，两个对照)进行了二代测序。(图3B)结果显示，大多数EV具有低数量的感兴趣蛋白，CD9是最丰富的(89%的EV具有该蛋白)，其次是CD81+ (25%)， CD63+ (12%)， CD11b+ (8.9%)， F4/80+(2.1%)和CD45+(1.1%)。接下来，我们确定了EV蛋白的共表达水平，(图3C)为巨噬细胞EV共阳性标记群体的环形图。最后进行的实验是将单个EV的seiSEQ结果与批量测量的结果进行比较，可以通过将seiSEQ数据相加来进行数学计算，(图3D)结果显示，流式细胞术测量的整体EV与seiSEQ测量的单个EV之间具有良好的相关性(R2=0.85)。
文章亮点(这篇文献的优点在哪？)
研究中利用乳液液滴和独特的探针来识别单个囊泡的内容，允许高通量分析
seiSEQ可以通过靶向单个EV上的多个表面蛋白，同时分析不同的蛋白
分析更多数量的囊泡有利于更好地分析EV亚群
有与多组学联合的潜力
我的疑问(这篇文献的不足在哪？)
- 本研究缺乏对同类型技术的差别和比较，以及与其他技术相比的优秀之处
和我相关(我从这篇文献里学到了什么？)
本文主要提出了一种名为seiSEQ的方法用于单囊泡表面膜蛋白质分析，这个技术的分析原理与PBA基本一致，只是实验操作上的区别
本文是一篇原理验证研究（proof of principle study, PoP），是临床药物开发的早期阶段，此时化合物在动物模型和早期安全性测试中显示出潜力。这一步骤的原理验证 （PoP） 或概念验证 （PoC） 通常将 I 期和剂量范围 II 期研究联系起来。
